Roseobacter 그룹에 의한 혐기성 티오황산염 산화는 해양 생물막에서 널리 퍼져 있습니다.

Nature Communications 14권, 기사 번호: 2033(2023) 이 기사 인용

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미생물에 의한 티오황산염 산화는 전 지구적인 황 순환에 큰 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 다양한 Roseobacter 계통 내의 박테리아가 해양 생물막의 티오황산염 산화에 중요하다는 증거를 제공합니다. 우리는 54개의 생물막 관련 Roseobacter 균주의 게놈을 분리하고 서열을 분석하여 티오황산염 산화 및 플라스미드에 대한 보존된 sox 유전자 클러스터를 찾아 틈새 특정 생활 방식을 지적합니다. 전 세계 해양 메타게놈 데이터 분석에 따르면 Roseobacter 균주는 돌, 인공 표면, 식물 뿌리 및 열수 분출구 굴뚝을 비롯한 다양한 기질의 생물막 및 매트에 풍부합니다. Metatranscriptomic 분석은 생물막의 활성 sox 유전자의 대부분이 Roseobacter 균주에 속함을 나타냅니다. 또한, 우리는 Roseobacter 균주가 호기성 및 혐기성 조건 모두에서 성장하고 티오황산염을 황산염으로 산화시킬 수 있음을 보여줍니다. 대표적인 균주에 의해 형성된 생물막의 전사체 및 막 단백질체 분석은 티오황산염이 sox 유전자 발현 및 세포막 단백질 구성의 변경을 유도하고 생물막 형성 및 혐기성 호흡을 촉진한다는 것을 나타냅니다. 우리는 Roseobacter 그룹의 박테리아가 혐기성 티오황산염 대사가 선호되는 해양 생물막의 주요 티오황산염 산화제라고 제안합니다.

미생물에 의한 무기 황 화합물의 순환은 중요한 생지화학적 발전입니다. 황 변환에는 해양 환경에 풍부한 티오황산염이 중간체로 포함됩니다1,2. 황산화세균에는 SUP05, SAR324, BS-GSO2, Chlorobi3 등 다양한 군의 독립영양세균이 포함되어 있는 것으로 잘 알려져 있다. 이 박테리아는 티오황산염 산화를 위한 SOx 다중 효소 경로를 사용하며, 티오황산염을 에너지 생산을 위한 전자 공여체로 사용하여 독립영양적으로 성장할 수 있습니다6. 티오황산염 산화의 최종 생성물은 박테리아에 따라 다릅니다. 특정 절대 유기 영양 박테리아(예: Pseudomonas stutzeri 및 Catenocossus thiosyclus)는 티오황산염을 불완전하게 테트라티오네이트로 산화시키는 반면, 다른 종속 영양 생물(예: Bosea 티오옥시단스 및 Limnobacter 티오옥시단스)은 티오황산염을 황산염으로 산화합니다. 대부분의 산화된 황은 독립 영양 황 산화 박테리아에서 흔히 볼 수 있는 유사한 경로에서 형성됩니다7. 암석 독립 영양 박테리아인 Paracoccus pantotrophus5,8에서 처음 발견된 전형적인 주변 세포질 다중 효소 시스템인 황 산화 효소(SOX) 시스템은 티오황산염 산화의 가장 잘 알려진 매개체입니다. 전자 수용체 활용 및 틈새 분포와 관련하여 호기성 티오황산염 산화제는 심부 엽록소 최대9, 연안 해수10 및 연안 해양 퇴적물11에서 분리된 반면, 혐기성 티오황산염 산화제는 최근 무산소 해양 분지12, 해양 산소 최소 구역13 및 열수 통풍구14에서 보고되었습니다. 또한, 환경 조건은 티오황산염 생산의 주요 생성물에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 해안 해양 퇴적물에서 티오황산염은 황화 및 산소 조건에 따라 다양한 비율의 테트라티오네이트 및 황산염뿐만 아니라 원소 황으로 산화됩니다.

많은 미생물의 중요한 틈새로서 생물막은 해양 미생물 바이오매스의 40%를 구성합니다15. 많은 미생물은 인공 물질, 암석 표면, 동물 가죽, 바다 눈과 같이 물에 잠긴 표면에 부착되기 시작하면 생물막을 형성합니다15,16. 해양 생물막 군집은 수백 종의 미생물로 구성될 수 있으며 구조적으로 생물막은 층화된 산소 농도, 영양분 및 신호 분자 측면에서 이질성을 특징으로 합니다17. 우리의 최근 연구18,19는 해양 생물막이 해수 미생물군에서 발견되지 않는 7000종 이상의 박테리아 종을 포함하는 알려지지 않은 분류군과 기능의 은행을 구성한다고 제안했습니다. 더욱이, 해양 생물막은 용해된 유기물 전환, 입자 재석회화, 표층수에서 심해로 영양분 전달과 같은 중요한 생지화학적 과정에 관여하는 것으로 보고되었습니다20. 그러나 아마도 복잡한 물리적 군집 구조와 분류학적 구성으로 인해 해양 생물막의 티오황산염 산화는 특히 다양한 분류군의 기여 및 관련 대사 특성과 관련하여 크게 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다. 구체적인 질문은 해양 생물막에서 티오황산염 산화에 가장 큰 기여를 하는 박테리아가 무엇인지, 그리고 이들이 이 과정을 어떻게 수행하는지입니다.

89% identity in the 16 S rRNA gene, are heterotrophs found worldwide in marine ecosystems. The so far discovered Roseobacter group comprises 327 species and 128 genera21, represented by Ruegeria (e.g, Ruegeria pomeroyi DSS-322, a model strain), Phaeobacter (well-known strains for the production of tropodithietic acid23), Sulfitobacter (widely-distributed strains in the global ocean24), and Loktanella (adapted to the polar regions25). Certain Roseobacter strains are reported to be associated with biofilms on surfaces of marine algae, invertebrates, and particles, although most of the isolated Roseobacter strains are free-living. For instance, analyses of the Tara ocean data suggested that Ruegeria mobilis strains occur in 40 and 6% of samples of the particle-associated fraction and the free-living fraction, respectively26, implying their preference for a biofilm-associated lifestyle. Physiologically, Roseobacter strains are often known for their metabolic versatility, mainly involving carbon monoxide oxidation, aromatic compound degradation, secondary metabolic production, and oxidation of sulfur compounds27,28,29. The genomes of several isolated Roseobacter strains contain sox genes, although their ability to oxidize thiosulfate has not been experimentally demonstrated. Moreover, as thiosulfate oxidation is affected by the availability of electron acceptors, it is possible that the oxygen gradient in biofilms may promote the development of novel thiosulfate-oxidizing bacteria./p>

0.1 mM) in the cultures was observed for the six strains (M382, M583, M619, S051, S190, and S2214) possessing the sox genes by barium precipitation after removing bacterial cells from the cultures, and sulfate production was detected (Supplementary Fig. 19). In particular, the sulfate production rate of Rhodobacteraceae sp. M382 is shown (Fig. 4a). This strain was selected as a model for the following analyses and experiments, because it probably represents a new genus and its genetic manipulation can be achieved. In both conditions, the sulfate concentration in M382 cultures increased along with the bacterial growth (Fig. 4a, b). In contrast, the sulfate concentrations in the cultures of two mutant strains of M382, M382-ΔsoxX, and M382-ΔsoxA, showed a slight decrease (Fig. 4a, b), confirming the role of sox genes in thiosulfate oxidation and sulfate production. The slight decrease in sulfate concentration may be due to assimilatory consumption of sulfate originally present in seawater. To confirm the production of barium sulfate, the pellet of a tested sample was examined by scanning electron microscopy (SEM) (Fig. 4c), and the dominant spectra of barium, sulfur, and oxygen were observed (Fig. 4d). These results suggested that the biofilm Roseobacter strains use sox genes for thiosulfate oxidation under both aerobic and anaerobic conditions. These results also showed that when grown planktonically, mutation of the soxX or soxA genes did not affect the growth of M382 (Fig. 4a, b), and motivated us to examine the growth of wild-type M382, M382-ΔsoxX, and M382-ΔsoxA in the biofilm state. After culture under aerobic or anaerobic conditions in artificial seawater media with 10 mM thiosulfate in biofilms, the wild-type strain displayed a significantly higher cell density than the two mutants (Supplementary Fig. 20), suggesting that thiosulfate oxidation may affect the bacterial growth when they have formed biofilms rather than grown planktonically./p>2 and P value <0.05 by Student’s t test) up-regulated by thiosulfate, 58 KEGG genes were down-regulated, while 4607 KEGG genes remained unchanged (Supplementary Fig. 21). Notably, the transcription of all sox genes was induced by thiosulfate (Fig. 5a). For example, there was over 14-fold induction of soxC transcription (Fig. 5a). Moreover, several genes related to anaerobic respiration were also induced by thiosulfate, including the ferredoxin-type protein-encoding gene napH (K02574), D-lactate dehydrogenase dld (K03777), the cytochrome c biogenetic gene ccdA (K06196), and anaerobic dimethyl sulfoxide reductase dmsC (K07308) (Fig. 5b). In addition, two ORFs encoding PorD (K11069), the substrate-binding protein of the spermidine/putrescine transport system, were up-regulated by thiosulfate, as well as an ORF encoding the outer membrane protein OmpW (K07275) (Fig. 5c), which has been reported to play a role in biofilm formation44,45. As examples, PotD is a spermidine/putrescine-binding periplasmic protein, and its overexpression strongly promotes biofilm formation in Escherichia coli44, and the mutant strain ΔompW of Acinetobacter baumannii showed reduced biofilm formation45. The full list of the genes with significantly higher transcription levels in the thiosulfate culture are shown in Supplementary Fig. 22, while the down-regulated genes are shown in Supplementary Fig. 23. It is worth mentioning that transcription of the sat gene (K00958) and three cys genes (K00381 and two K00390 genes) were down-regulated by thiosulfate (Supplementary Fig. 23), suggesting the inhibitory effect of thiosulfate on sulfate reduction./p>2 and P value <0.05 (*P value <0.05; **P value <0.01; ***P value <0.001). Exact P values in a: 0.0002, 0.0005, 1.7E-05, 0.0136, 0.0031, 0.0013, 0.0225; b: 0.0011, 0.0032, 7.5E-07, 1.5E-06, 7.8E-08, 3.8E-06, 0.0001; c: 0.0067, 0.0032, 0.0039, 0.0251; d: 4.5E-05, 0.0014, 0.0173, 0.0015, 0.0006, 0.0008, 0.0183, 0.0120; e: 0.0469, 0.0353, 0.0255; f: 0.0006, 0.0001, 0.0013, 0.0002, 0.0053, 0.0075, 0.0004, 0.0048, 0.0023, 0.0112. Source data are provided as a Source data file./p>9000 bp), and Illumina sequencing was performed on the NovaSeq 6000 system to generate 2 Gb of data (read length = 150 bp). Preliminary assembly and correction were performed with SMRT Link v5.0.1 (CCS = 3, minimum accuracy >0.99), and then corrected by the Illumina data using Minimap2 (Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences). In detail, the PacBio-derived contigs were mapped with the Illumina reads, and the locations without alignment were corrected according to the contigs assembled from Illumina reads. The chromosome and plasmid sequences were distinguished based on the reads coverage and screened by BLASTn to form a complete genome. Genome annotation was performed on a local Linux platform. Ribosomal RNA genes (rRNA) and transfer RNA genes (tRNA) were predicted using the software Barrnap (https://github.com/tseemann/barrnap) and Aragorn64, respectively. ORFs were predicted using Prodigal (version 2.60)65 in a single-genome analysis model with close-end ORF prediction. For phylogenetic analysis, 31 essential marker genes (dnaG, frr, infC, nusA, pgk, pyrG, rplA, rplB, rplC, rplD, rplE, rplF, rplK, rplL, rplM, rplN, rplP, rplS, rplT, rpmA, rpoB, rpsB, rpsC, rpsE, rpsI, rpsJ, rpsK, rpsM, rpsS, smpB, and tsf) were extracted from the genomes using AMPHORA266. The protein sequences of these marker genes were aligned using MEGA (version 6.05)67 to construct a maximum-likelihood tree under the Jones–Taylor–Thornton mode. The marker genes were aligned individually and then concatenated to generate alignments for tree construction. The tree was built in MEGA67 and bootstrap values were calculated with 500 replicates. ANI was calculated using the software fastANI68 installed in a local Linux system. Two different species show <95% ANI69, and two different strains have <99% ANI70. For functional gene annotation, the protein sequences of a given genome searched with BLASTp (E-value <1e-7) against the KEGG database (2022 version). Metabolic pathways were reconstructed using the online server KEGG Mapper (https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)./p>

1 were used as the thresholds of significance. Differentially expressed genes were illustrated using volcano plots drawn in MS Excel and heatmaps drawn with Cluster 3.0 (hierarchical clustering with average linkage79) and Java TreeView80./p>2 and P value <0.05./p>